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改进生物化学实验课“动物组织中核酸的提取与鉴定”
来源:互联网 qikanw | 刘畅1,芮雪1,贾绍辉1,王慧1
【分  类】 基础科学
【关 键 词】 生物化学实验课程;动物组织;核酸;提取与鉴定;教学质量
【来  源】 互联网
【收  录】 中文学术期刊网
正文:

  [摘要]生物化学实验课程在生物化学教学中占有重要的地位,将“动物组织中核酸的提取与鉴定”由核酸定性实验改为定量实验,从牛、大鼠和猪的组织中提取、检测DNA和RNA,同时比较大鼠心、肝、脾、肺、肾五种脏器的DNA与RNA,目的是更多地训练学生(特别是少数民族学生)的实际操作能力,提高生物化学实验教学的质量。

  [关键词]生物化学实验课程;动物组织;核酸;提取与鉴定;教学质量

  中图分类号:G642.423 文献标识码: A 文章编号

  生物化学是一门实践性和实用性很强的学科,也是药学专业极为重要的专业基础课程之一[1],与之相配套的生物化学实验课在生物化学理论教学中起着极为重要的作用,它帮助学生复习和理解生物化学理论课的相关知识,训练学生基本实验操作,掌握一些基本仪器的使用方法,锻炼学生实际操作能力,提高和培养学生思考问题、分析问题和解决问题的能力。通过对“动物组织中核酸的提取与鉴定”这一生物化学实验课程相关内容如取材、操作过程、显色检测等方面的改进,让学生、特别是少数民族学生积极参与实验操作,让更多的学生了解不同动物、不同组织、不同脏器中核酸的差异,培养和提升学生对生物化学实验课的兴趣,也有助于提高生物化学实验课的教学质量,为教师及时了解和掌握学生实验能力提供原始信息。

  1 实验的仪器、试剂和材料

  1.1 仪器:DS-1高速组织捣拌机,上海标本模型厂;721分光光度计,上海第三分析仪器厂;80-2离心沉淀器,上海手术器械厂。

  1.2 化学试剂:地衣酚、二苯胺、氯化钠、氯仿、丙酮、异戊醇等均为市售分析纯或化学纯。

  1.3 材料:市售新鲜猪肝;SD大鼠,清洁级;市售新鲜牛肝。

  2 实验方法

  2.1 取猪肝、牛肝和SD大鼠肝脏按参考文献[2]进行平行实验,分别提取DNA和RNA,比色测定其吸光值。将多次实验的结果取平均值,并计算标准偏差。

  2.2 取大鼠的心脏,肝脏,脾脏,肺和肾脏进行平行实验,分别提取DNA和RNA,比色测定其吸光值以表示提取出来的核酸的量。将多次实验的结果取平均值,并计算标准偏差。

  2.3 具体方法如下:

  1)大鼠取内脏:取3只大鼠,快速颈椎脱臼除死,分别称重。取出每只大鼠的脏器(心脏,肝脏,脾脏,肺,肾脏),用冷的0.14mol/L氯化钠溶液洗去血水,称重,分别放入冰浴中,以防氧化。记录下每只大鼠的体重及各个脏器的重量。

  2)购买市售新鲜的猪肝、牛肝,称重。

  3)组织匀浆:用医用小剪刀将各种肝脏归类剪成碎块,按脏器重量与0.14mol∕L氯化钠溶液体积之比(g/mL)1:4的比例,高速间断匀浆,10000-12000转∕分,每次10秒共计5次。

  4)RNA的提取与鉴定[3]:用刻度离心管量取10mL组织匀浆,以3000rpmⅹ10min,分离上层清液和沉淀物(沉淀物用于DNA的提取),上层液体用等体积的氯仿和3~4滴异戊醇抽提15min,再离心3000rpmⅹ10min,取上清,以二倍上清体积的冷乙醇沉淀,静置10min,3000rpmⅹ10min离心,沉淀物用0.14mol∕L氯化钠溶液4mL的充分溶解,取1mL溶解液加3mL的地衣酚试剂,煮沸10min,冷却后在670nm波长下比色,读取吸光值。

  5)DNA的提取与鉴定[3]:沉淀物用等体积的1mol∕L氯化钠溶液吹打均匀后,室温静置30min,以3000rpmⅹ10min离心,获得的上层清液用等体积的氯仿和3~4滴异戊醇抽提,方法同RNA制备。冷乙醇沉淀、静置、离心得到沉淀物,以2mL的1mol∕L氯化钠溶液吹打均匀、完全溶解后,取1ml溶解液加3mL二苯胺试剂,煮沸10min,冷却后595nm波长下比色,读取吸光值。

  3 结果与分析

  3.1 猪肝、牛肝与大鼠肝脏中每克组织所含的DNA与RNA的比色定量结果见表1。

  表1 猪肝、牛肝和鼠肝DNA与RNA比色结果比较(n=5) 猪肝 牛肝 鼠肝 DNA(A595) 0.29±0.021 0.16±0.047 0.38±0.093 RNA(A670) 0.38±0.015 0.54±0.051 0.87±0.053 该数据表明,提取的大鼠肝脏DNA和RNA量均高于猪肝与牛肝的DNA和RNA。其中,牛肝的DNA量最少,猪肝的RNA量最少。实验结果如图1所示。

  3.2 大鼠的5种脏器中每克组织所含的DNA与RNA的比色定量结果见表2。

  表2 大鼠5种脏器DNA与RNA比色结果比较(n=5) 心脏 肝脏 脾脏 肺 肾脏 DNA(A595) 0.09±0.015 0.15±0.055 0.50±0.024 0.06±0.012 0.11±0.038 RNA(A670) 0.50±0.046 1.05±0.036 0.17±0.062 0.28±0.032 0.27±0.081 该数据显示,平行提取的大鼠肝脏组织RNA含量最丰富,心脏次之,脾脏最低;而相反的,脾脏组织DNA含量最高。实验结果如图2显示。

  4 结语

  核酸是生命科学领域的核心教学内容之一,在医药研究领域尤为重要[4]。它阐明生命现象的化学本质,也是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘的主要途径之一,有关核酸的实验同样也是生物化学实验课的重要教学内容。

  我国是一个多民族国家,不同民族有着不同的宗教信仰。回、维吾尔、哈萨克、柯尔克孜、乌孜别克、塔吉克、塔塔尔等少数民族信奉穆斯林的传统生活习惯,不仅在饮食上忌食猪肉和猪源食品,来自这些民族的学生甚至不愿意接触与猪有关的实验,而中国药科大学生源来自全国各地,回、维吾尔、哈萨克、乌孜别克等少数民族学生约占学生总数的5%,为了这些学生的生物化学实验,初步尝试利用非猪源的其他动物脏器组织替代猪肝,以保证生物化学实验课的正常进行,同时也让这部分少数民族学生的实验操作技能得到锻炼[5]。

  猪肝、牛肝和大鼠肝脏的DNA与RNA显色定量检测的比较结果表明,来自大鼠的DNA和RNA实验数据均高于猪肝和牛肝的DNA和RNA。分析其主要原因可能是大鼠是实验课开始之前刚刚宰杀,而猪肝和牛肝则是从菜市场里购买,因此推测主要原因之一是大鼠肝脏组织新鲜度高于猪肝。

  大鼠各脏器的核酸结果显示,大鼠肝脏提取的RNA明显比其他脏器多,这是因为肝脏组织的代谢要比其他组织旺盛,因此肝脏核酸的合成也就要高。脾脏中的DNA含量则要高于其他脏器,故有时使用脾脏来提取DNA。

  从实验教学资源上考虑,给学生提供猪肝组织作为实验选材有较大优势,主要是猪肝来源丰富,任何大的生活超市、菜场都销售,而且价格便宜,平均为20-24元∕kg,一个班级按32人,二人一组10ml匀浆,则一个班大约需要50g左右的猪肝,折合人民币也就一元钱;而普通级的SD大鼠的价格平均为25元∕只,以肝脏∕体重约4.07%的参数[3],若要50kg左右的鼠肝大约要4-6只大鼠,折合人民币100-150元,一个班级仅这一个实验的成本就提高了百倍之多。

  在实验经费不足的条件下,折中的方法是信奉穆斯林的少数民族学生使用大鼠脏器匀浆,其他学生使用的实验材料仍然是猪肝组织;另外,实验材料可以利用牛肝替代猪肝,初步的牛肝匀浆的DNA与RNA的定量实验已经证明其方法的可行性,而且价格和猪肝价格相近,但在本地区购买起来相对困难。

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